上?？蒲屑夹g(shù)服務(wù)實(shí)驗室 推薦咨詢(xún) 上海研錄生物醫藥供應

準備碎冰和。把膜置于甲醇溶液中活化1分鐘，然后轉移至轉膜液中平衡3分鐘后備用。2、轉膜組裝轉膜三明治夾，這一步很關(guān)鍵，重要的是膠和膜之間不能有氣泡且膜與膠要保證貼合緊密(否則會(huì )翻車(chē))，可以加多點(diǎn)轉膜液泡著(zhù)。組裝好后加滿(mǎn)轉膜液，設置電源參數，我習慣恒流轉膜，200-280毫安，1-2小時(shí)，根據分子量定，如50KD的分子用60分鐘就夠了。如果一個(gè)電源帶兩個(gè)轉膜大槽即四塊膠，我就會(huì )用恒壓70-110V。這個(gè)過(guò)程重要的是做好降溫。這里簡(jiǎn)單說(shuō)一下蛋白分子量與玻璃板厚度，分離膠的濃度，轉膜電源參數的選擇問(wèn)題。如果是能用1毫米的玻璃板就不用，因為轉膜是在電場(chǎng)的作用下蛋白分子從膠上遷移到膜上，1毫米膠的蛋白遷移距離要比。選擇更薄的膠蛋白轉膜時(shí)間可以減少，從而減少發(fā)熱，以免膠變形，條帶也會(huì )更好看。然后是分離膠的濃度，如果是150—200KD的分子選10%以下的的分離膠，200—300KD的選8%的,300KD以上的選6%的，小于30KD的200mA30分鐘，30-100KD的按分子量的數值算，如70KD，250mA70分鐘;100-150KD的250mA100分鐘;150—300KD的分子轉膜條件用280毫安(以上均是對于，)，120分鐘足矣，前提是膠的濃度相適應。五、封閉孵一抗1、封閉轉膜結束后?？蒲屑夹g(shù)服務(wù)不僅提升了科研項目的成功率，也促進(jìn)了科研人才的培養與發(fā)展。上?？蒲屑夹g(shù)服務(wù)實(shí)驗室

外泌體作為藥物載體由于特殊的結構和循環(huán)方式，外泌體作為藥物運輸的載體具有獨特的優(yōu)勢。例如外泌體的尺寸分布能夠增強滲透滯留效應，從而有選擇性地深入組織;其外層磷脂雙分子層可以保護內容物不受各種生物酶的影響，維持各種生物分子的活性;外泌體普遍存在于各種體液和組織中，其體積小，結構、組成與細胞膜類(lèi)似，導致外泌體可以在避開(kāi)免疫系統監督的同時(shí)深入組織內部，有較好的生物相容性;當采用內源外泌體時(shí)，能明顯降低其他藥物載體可能引起的有害免疫反應;除此之外，某些細胞來(lái)源或經(jīng)特殊修飾過(guò)的外泌體具有良好的特異性，可以與特定的或組織結合。因此，載藥成為外泌體研究的一個(gè)重要分支，具有良好的應用前景。在外泌體中引入藥物的方式包括體內裝載和體外裝載兩種。體內藥物裝載可以通過(guò)傳統方法(如病毒轉染、脂質(zhì)體轉染或電穿孔等)轉染來(lái)源細胞，編碼感興趣的RNA或蛋白質(zhì)，也可以使藥物與來(lái)源細胞共混，使細胞分泌產(chǎn)生含有目標生物分子的外泌體。體外藥物裝載則首先需要得到純化的外泌體，然后將感興趣的藥物通過(guò)電穿孔或脂質(zhì)體轉染等方法裝入純化的外泌體。外泌體內可裝載的藥物包括小分子化學(xué)藥物、蛋白質(zhì)和多肽、核酸藥物、天然產(chǎn)物等。上海實(shí)驗科研技術(shù)服務(wù)分離由于大部分研究使用到的是人類(lèi)來(lái)源的細胞，種植到免疫正常的動(dòng)物體內會(huì )發(fā)生免疫排斥反應。

原理以慢病毒包裝為例，主要包括3個(gè)質(zhì)粒：質(zhì)粒DNA可以轉錄出慢病毒遺傳物質(zhì)(RNA)，但不能翻譯出慢病毒的外殼及蛋白成分的載體質(zhì)粒，其同時(shí)含有目的基因和報告基因，psPAX2是可以表達慢病毒外殼的質(zhì)粒，其表達產(chǎn)物可通過(guò)粘附機制更易穿過(guò)細胞膜。為慢病毒的膜蛋白質(zhì)粒，通過(guò)脂質(zhì)體進(jìn)行三質(zhì)粒共轉到靶細胞基因組中，宿主基因組在表達時(shí)，隨宿主基因轉錄出的目的基因RNA與psPAX2、基因翻譯出的蛋白組裝為慢病毒。病毒進(jìn)入細胞后，其遺傳物質(zhì)RNA逆轉錄出DNA，該基因再整合到靶細胞的基因組中，完成轉染過(guò)程。因為質(zhì)粒DNA只能轉錄出病毒RNA和表達目的基因卻不能表達出病毒的外殼和膜蛋白成分，因此其不能像普通的病毒一樣在宿主細胞能反復增殖，故對宿主細胞是無(wú)害的并且高效的將目的基因轉染到靶細胞基因組中。用途病毒產(chǎn)生，包裝病毒。材料與儀器無(wú)菌1×PBS，對數期293T細胞，細胞計數器，病毒質(zhì)粒(以慢病毒為例：psPAX2/)，轉染試劑(lipMax或者lipo3000)，Polybrene、病毒濃縮液(生物公司有售)等。步驟(1)293T細胞鋪板取對數生長(cháng)期的293T細胞，用的胰蛋白酶消化293T細胞，計數。若是10cm大皿，建議按照10-12×106每皿的數量將293T細胞均勻鋪入。若是6孔板。

一種是用beta巰基乙醇打開(kāi)蛋白質(zhì)分子二硫鍵的，另一種是用DTT(二硫蘇糖醇)。兩者的作用是一樣的，但特點(diǎn)不一樣，前者更容易與氧氣反應，穩定性比后者差，如果在常溫下暴露在空中，前者只能維持24小時(shí)的活性，后者卻可以維持7天左右。所以該如何選擇?如果是蛋白樣品較少，跑幾次就可以用完的樣品，這時(shí)選擇beta巰基乙醇。如果樣品很多，計劃跑上幾十次的，優(yōu)先選擇DTT,建議變性后分裝保存。二、SDS-PAGE凝膠配制1、配膠前準備首先強調一下，一塊好的膠是跑好蛋白的前提，所以這個(gè)環(huán)節也不容忽視。玻璃板的選擇，一種是1毫米厚度的，另一種是，這個(gè)厚度選擇也是有講究的，如果上樣體積小于10微升，優(yōu)先選1毫米，否則選。原因是什么?**在轉膜部分揭曉。還有分離膠的濃度也要選擇適合的。然后玻璃板和梳子要洗干凈，晾干。裝板，注意厚板和薄板的底部要對齊，否則會(huì )漏膠。加制膠的各成分前，要觀(guān)察液體是否有沉淀，有沉淀的盡量不要用。2、制膠按配方說(shuō)明依次加入各組分，加完SDS后先簡(jiǎn)單手動(dòng)搖勻幾下，然后迅速加入過(guò)硫酸銨和TEMED,搖勻，緊接著(zhù)就灌膠。然后我習慣用95%的酒精壓膠，我也用過(guò)純水，感覺(jué)純水壓沒(méi)那么好，由于水的密度較大，會(huì )把分界處的膠壓得膨大。人工模型是指通過(guò)人工手段制造的疾病模型。

m6A修飾圖譜構建及作用機制：通過(guò)m6A甲基化測序（MeRIP-Seq,miCLIP）構建疾病細胞模型或者發(fā)病組織的m6A修飾譜，分析m6A的motif,peaks數量及分布，Peak關(guān)聯(lián)基因的特征，聯(lián)合RNA-seq研究m6A甲基化與表達的關(guān)系。m6A研究思路方案一方案二研究案例1、.(IF=)為研究ALKBH5的m6A作用機制，作者利用芯片和m6A-seq篩選到膠質(zhì)瘤增殖相關(guān)的FOXM1，通過(guò)qPCR、WB、免疫熒光、核質(zhì)分離WB/qPCR、RIP和MeRIP等實(shí)驗證明ALKBH5通過(guò)去甲基化調節FOXM1在GSCs中的表達。為研究ALKBH5對FOXM1的作用是否受其他因子的調節，作者研究了FOXM1的鄰近基因，發(fā)現lncRNAFOXM1-AS與FOXM1序列互補，且共表達、共定位，進(jìn)一步通過(guò)RIP,RNApulldown等實(shí)驗證明lncRNAFOXM1-AS促進(jìn)ALKBH5和FOXM1初級轉錄本的相互作用。通過(guò)細胞實(shí)驗進(jìn)一步驗證ALKBH5在lncRNAFOXM1-AS的作用下維持FOXM1的表達和細胞增殖，從而維持GSCs的干性。圖3ALKBH5敲除細胞中m6A修飾的特征和基因表達的變化2、RNAN6-methyladenosinemethyltransferaseMETTL3promoteslivercancerprogressionHepatology,2017.(IF=)表觀(guān)遺傳改變極大地促進(jìn)了人類(lèi)癥的發(fā)生。傳統的表觀(guān)遺傳研究主要集中在DNA甲基化，組蛋白修飾和染色質(zhì)重構。近。腫瘤細胞侵襲能力檢測在學(xué)（遷移、侵襲）和免疫學(xué)（遷移、趨化）中是常規實(shí)驗。上海小鼠科研技術(shù)服務(wù)分離

常見(jiàn)的5種實(shí)驗動(dòng)物取血方式，你掌握幾種？上?？蒲屑夹g(shù)服務(wù)實(shí)驗室

RNA各種可逆的化學(xué)修飾被認為是一種新的表觀(guān)遺傳調控方式。m6A是真核生物mRNA常見(jiàn)的化學(xué)修飾，在調控mRNA穩定性，剪切和翻譯方面具有重要的作用。作者使用轉錄組測序發(fā)現了METTL3（甲基轉移酶3），一種主要的RNAN6-腺苷-甲基轉移酶，在人肝細胞（HCC）和多種實(shí)體中高表達。在臨床上，METTL3的過(guò)度表達與肝細胞患者不良預有關(guān)。體外實(shí)驗證明敲除METTL3會(huì )抑制HCC細胞增殖，遷移及克隆形成。體內實(shí)驗證明敲除METTL3會(huì )明顯抑制HCC體內成瘤和肺轉移。另外，使用CRISPR/dCas9-VP64系統，內源性高表達METTL3會(huì )促進(jìn)HCC細胞在體外和體內生長(cháng)。通過(guò)轉錄組測序、m6A-Seq、MeRIP-PCR，作者確定了SOCS2（細胞因子信號2的抑制因子）作為METTL3介導的m6A修飾的下游靶基因。敲除METTL3表達會(huì )消除SOCS2mRNAm6A修飾并增強SOCS2mRNA表達。m6A介導的SOCS2mRNA降解是依賴(lài)于m6A“讀取器”蛋白YTHDF2?？傊?，METTL3在HCC大部分高表達中,并通過(guò)m6A-YTHDF2依賴(lài)機制抑制SOCS2表達從而促進(jìn)HCC進(jìn)展。因此，作者發(fā)現了在肝發(fā)生過(guò)程中表觀(guān)遺傳改變的一種新機制。圖4RNA甲基化轉移酶METLLT3在肝組織中高表達。上?？蒲屑夹g(shù)服務(wù)實(shí)驗室